Development and Validation of a Liquid Chromatographic Method for CasiopeinaIII-ia® in Rabbit Blood and its Application in Pre-clinical Pharmacokinetic Research

Abstract

Abstract. A rapid and simple high-performance liquid chromatography (HPLC) method using extraction with zinc sulfate was developed for determining Casiopeina III-ia (CasIII-ia) levels and then validated for the linear 10-120 µg/mL range in 200 µL of rabbit blood. An HPLC method for quantifying CasIII-ia in plasma has been previously reported; however, studies on its distribution found that CasIII-ia concentrations were higher in whole blood than in plasma. The analysis was performed using the following parameters: methanol-sodium phosphate buffer (pH 6.5; 0.01 M) (40:60 v/v) mobile phase, using a 250 x 4.6 mm I.D Symmetry^® C₁₈ column and a particle size of 5 µm (Waters Associates, Milford, MA, USA) with a C₁₈ 5 µm guard column (Phenomenex^®) was kept at a isocratic flow-rate of 0.8 ml/min, room temperature at a wavelength of  262 nm.  Acetaminophen was used as the internal standard. The results showed that the assay is sensitive at 10 µg/mL. A linear relationship of r²=0.9954 for Cass-III-ia was plotted against concentrations ranging from 10 to 120 µg/mL; the analytical method complies with linearity. The maximum intra-day relative standard deviation (RSD)  was 5.10 %. An average 84.8 % intra-day (n=15) and 92.5 % inter-day (n=30) recovery % of CasIII-ia was recovered for the whole blood samples. The results demonstrated the applicability of this method for obtaining it’s in vitro distribution and also it´s for use in pharmacokinetic studies at the preclinical level on rabbits. The present study shows an assay rapid, simple, precise, and accurate for quantifying Cas III-ia in rabbit whole blood. The pharmacokinetic study, carried out in rabbits, obtained the following pharmacokinetic parameters: (kel) = 0.0150 min-¹; half-life time (T_1/2) = 53.9 min; with an apparent volume of distribution (Vd) = 202.8 mL; clearance (Cl) = 2.0 mL /mi; and area under the curve (AUC)=23163.8 µg/mL.min. The results contribute to the preclinical characterization of Cas III-ia.

Resumen. Se desarrolló un método rápido y sencillo por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando la extracción por precipitación con sulfato de zinc para determinar los niveles de Casiopeína III-ia (CasIII-ia), se validó en un rango lineal de 10-120 mg/mL en 200 µL de sangre de conejo. Un método HPLC para cuantificar Cas III-ia en plasma ha sido reportado previamente; sin embargo, estudios realizados sobre su distribución encontraron que las concentraciones de Cas III-ia eran más altas en sangre total que en plasma. El análisis se realizó utilizando los siguientes parámetros: fase móvil fue metanol y solución amortiguadora de fosfato sódico (pH 6,5; 0,01 M) (40:60 v/v) a un flujo de 0,8 mL/min, temperatura ambiente a una longitud de onda de 262 nm. Se utilizó acetaminofén como estándar interno. Los resultados obtenidos mostraron que el ensayo es sensible a 10 µg/mL. Se encontró una relación lineal de r²=0.9954 para CasIII-ia contra concentraciones que van de 10 a 120 µg/mL; el método analítico cumple con la linealidad. La desviación relativa estándar (RSD) fue de 5.10 %. La media del  recobro fue de  84.8 % intra-dia (n=15) y de 92.5 % inter-día (n=30) para Cas III-ia en muestras de sangre total. Los resultados demuestran la aplicabilidad de este método para la obtención de la distribución in vitro y para su uso en estudios farmacocinéticos  a nivel preclínico en conejos. El presente estudio muestra un ensayo rápido, sencillo, preciso y exacto para cuantificar CasIII-ia en sangre total de conejo. El estudio farmacocinético, realizado en conejos se obtuvieron los siguientes parámetros farmacocinéticos: (kel) = 0,0150 min-1; tiempo de semivida (T_1/2) = 53,92 min; volumen aparente de distribución (Vd) = 202,8 mL; aclaramiento (Cl) = 2,0 mL /mi; y área bajo la curva (AUC)=23163,8 µg/mL.min. Los resultados contribuyen a la caracterización preclínica de Cas III-ia.